發布時間：2023-06-07 15:35:09
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【關鍵詞】釘螺；血吸蟲病；生物學特性；人工培養；綜述
【中圖分類號】R532．21【文獻標識碼】A【文章編號】1673－5234（2015）12－1148－03
血吸蟲?。╯chistosomiasis）是一種嚴重的共患寄生蟲病，呈全球分布。在我國主要流行的是日本血吸蟲病。2013年全國共報告血吸蟲病感染184943例，晚期血吸蟲病患者29796例［1］，血吸蟲病的流行位居水傳播疾病之首，嚴重影響我國的社會經濟發展和人類健康。釘螺（Oncomelaniahupensis）是日本血吸蟲的唯一中間宿主，主要分布在亞洲東部和東南部，中國內地僅有湖北釘螺一種，釘螺分布與血吸蟲病的流行息息相關。目前防控該病最常用的方法是消滅釘螺，人工培養釘螺對研究釘螺的生物學特性和篩選滅螺藥物具有重要意義。本文對釘螺的生物學特性和人工培養的方法進行綜述。
1釘螺的生物學特性
1．1形態學
釘螺為水陸兩棲，常棲息于田間、池藻等淡水水域。它主要由螺殼和軟體兩部分組成，軟體部分的前部為頭、頸、足和外套膜，后部是內臟；表面有縱肋者稱“肋殼釘螺”，殼長約10mm，寬約4mm。殼面光滑者稱為“光殼釘螺”，比肋殼釘螺稍小，長、寬分別為6mm和3mm，多見于山丘地區。釘螺形態學特點主要包括形態特征、解剖結構等方面。釘螺早期的研究重點集中在釘螺內外部的形態結構變化，如螺殼形狀、螺肋的數目及厴核的旋數［2］，并以此來認識與鑒別釘螺，如巴西釘螺被認為是光殼釘螺的一種，螺殼黑色，螺殼外唇無隆起線，殼光滑有黃色“假眉”，厴與齒舌與湖北釘螺相同［3］。釘螺的形態特征是研究釘螺的分類、遺傳和進化的基礎，分布于山區的光殼釘螺和分布于湖沼水網地區的肋殼釘螺生存條件不同。湖北釘螺具有遺傳多樣性，而且具有不同程度的遺傳變異［4］。石朝輝等［5］通過對湖北廟河上下游釘螺調查發現，兩個地區釘螺分別為光殼釘螺和肋殼釘螺，上下游螺群的遺傳距離并無明顯差異。
1．2分類學
釘螺俗稱釘螺螄，為動物界第二大動物門－軟體動物門腹足綱中的一類，有雌雄之分。早期對釘螺分類的研究主要是以釘螺形態學和解剖學為依據的，自1913年宮入慶之助和鈴木稔在日本證實光殼釘螺為日本血吸蟲的中間宿主以來，對釘螺分類的依據主要是根據形態和解剖結構，如螺殼、螺厴和螺肋數目及齒舌形態特征。美國Bartsh根據螺旋數、齒式將釘螺分為Oncomelania、Katayama和Schistomophora［6］。有學者發現螺殼顏色、螺厴、齒舌等差異不大，認為釘螺的分類以形態結構為依據并不嚴謹［7－8］。近年來分子生物學技術的發展對釘螺分類的研究起到了重要作用。George等［9］通過對中國大陸不同地區、不同種群釘螺的同工酶進行比較，再結合螺殼形態學的基礎將湖北釘螺再分成3個亞種：滇川亞種（O．h．robertsoni）、福建亞種（O．h．tangi）和湖北亞種（O．h．hupensis）。牛安歐等［10］利用單重復序列錨定PCR技術（SSR－PCR）將中國大陸7省的湖北釘螺分為4類。周藝彪等［11］采用微衛星錨定PCR分子技術對19個種群釘螺的基因DNA進行分析，進一步驗證了中國大陸湖北釘螺分為滇川亞種、廣西亞種、福建亞種和指名亞種等4個亞種。
1．3遺傳學
釘螺的生物特征、地理分布以及日本血吸蟲和釘螺之間的相容性都與釘螺遺傳學特性密切相關。表觀遺傳學、分子遺傳學和景觀遺傳學的研究應用在生物滅螺中起著不可替代的作用。早期，表觀遺傳學常用來作為釘螺分類依據，劉月英等［12－13］認為中國大陸釘螺屬于一屬一種，世界各地釘螺作為同一種屬只有種下亞種和地理株之分，但種下具體如何分類尚未得到解決。隨著分子生物學的發展，釘螺種群同工酶譜的分析、DNA基因序列的研究進一步得到發展。日本血吸蟲與釘螺之間的相容性主要取決于兩者之間的同工酶等位基因［14］，而且不同種群的釘螺對日本血吸蟲的相容性不同［15］。周曉農等［16］研究了中國9省34個地區螺群的同工酶，結果表明釘螺種群間的變異程度較大，而同種群內的變異較小，肋殼釘螺的遺傳變異分化程度小于光殼釘螺，且釘螺從喜馬拉雅山脈擴散至世界各地，因環境變化，基因也發生了劇烈漂移。景觀遺傳學是在2003年由Manel［17］首次提出，其結合了景觀生態學和種群遺傳學的特點，意義在于研究物種微進化與景觀環境之間的關系，為研究釘螺遺傳變異分化提供了新的研究方法［18］。崔斌等［19］采用微衛星錨定技術對湖北松滋地區不同景觀環境下釘螺遺傳特性進行分析，結果表明湖北釘螺種群間遺傳變異并不明顯，而釘螺個體間變異顯著。景觀遺傳學作為一門新興學科，將人類及其活動納入了研究范疇，在理論和方法方面有很大的發展空間。
1．4生態學
釘螺繁殖、分布及擴散等生態學特征與血吸蟲病的流行息息相關。釘螺生態學的研究對血吸蟲病的傳播和預防可以起到理論指導作用。釘螺的生長繁殖易受滅螺藥物和環境改變的影響，其分布密度與植被蓋度有關［20］。林丹丹等［21］對鄱陽湖的自然環境進行研究發現植被總蓋度與釘螺分布成正比，總蓋度越高釘螺分布越廣。地形是影響釘螺分布重要的因素之一，楊慧等［22］對云南地形的考察，發現云南地形以山區為主，呈孤島性分布，擴散不明顯，建議滅螺范圍應以陽性釘螺分布地區為主，并適當擴大范圍。釘螺的擴散方式主要以主動擴散和被動擴散為主，水流、光照強度、釘螺吸附能力以及水中障礙物均可影響釘螺的擴散［23］。此外，自然因素和社會因素如水災、水利工程建設及旅游開發等也可影響釘螺分布與擴散。
1．5生理生化
釘螺的生理生化對研究滅螺藥物的作用機制以及滅螺效果具有重要意義。杜小華等［24］用不同濃度的水和乙醇提取物配置成不同濃度的羊躑躅溶液進行滅殺釘螺實驗，結果顯示濃度不同的提取物處理釘螺后的滅殺率不同，其中以70％乙醇提取物滅殺釘螺的效果最佳。周康等［25］通過實驗發現瑞香狼毒同上述幾種藥物一樣對釘螺的主要能量代謝物質糖原有較強的抑制作用，而且以濃度為70％乙醇提取物的效果最好。黃春蘭等［26］用硫酸、蒽酮比色法鑒定湖北釘螺各月份的肝、頭足部肌肉和整體軟體組織的糖原含量，結果表明整體軟體組織和肝的糖原含量隨著時間的推移而下降。吳明煜等［27］用不同濃度的蛇床子總香豆素處理液浸泡釘螺，在浸泡液處理的前96h內，釘螺體內糖原的含量隨著浸泡時間的延長而降低，說明蛇床子總香豆素可以影響釘螺的糖原含量。胡彥龍等［28］研究發現田皂角甙當濃度超過0．80g／L時可以明顯降低釘螺體內糖原含量，降低的幅度達12．49％～73．16％。劉金濤等［29］發現濃度大于0．85g／L的苦楝子可以降低釘螺內的糖原含量，降低幅度為10．78％～69．94％。過氧化物酶、三磷酸腺苷酶、琥珀酸脫氫酶、乳酸脫氫酶是釘螺進行有氧呼吸的關鍵酶，抑制這些酶的合成可以有效地殺滅釘螺。顧文彪等［30－31］用苦楝葉提取液浸泡釘螺發現三磷酸腺苷酶、琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氫酶降低，而一氧化氮合成酶增高，一氧化氮合酶的升高可以使NO合成增加，破壞釘螺機體內的線粒體氧化磷酸化，使能量合成受抑制，達到殺滅釘螺的效果。王萬賢等［32］分別采取樟樹的新鮮葉、莖皮和根皮調配成1％、0．5％、0．1％、0．05％等4個不同濃度的溶液處理釘螺，結果顯示釘螺體內的過氧化物酶的活性隨著浸泡的時間延長活性降低，其中以根皮的效果最好，葉的效果較差，建議大量種植樟樹作為生態林可達到較好的抑螺效果。
2釘螺的人工培養研究
2．1釘螺螺卵的孵化和幼螺的生長
對于釘螺螺卵的孵化和幼螺的生長，主要的影響因素為溫度、水和食物。釘螺螺卵的正常孵化需要在水中或是濕潤的泥面上［33］，飼料以奶粉及復合動物飼料為主，其中藻類喂養幼螺存活率較高，達90％以上，且生長良好［34－35］。田建國等［36］采用了收集螺卵恒溫孵化法、直接恒溫孵化法和自然狀態孵化法三種方法對釘螺螺卵進行孵化，結果顯示泥土也可以影響釘螺螺卵的孵化。
2．2成螺的人工培養
成螺培養因實驗目的不同，室內培養方法也不盡相同，常用室內培養感染性釘螺是泥盤草紙飼養法［37］。成螺培養主要為感染性釘螺，其中毛蚴感染釘螺的比例至關重要，張聰等［38］采用泥缽內鋪細土泥法，按毛蚴與釘螺數量比為5：1、10：1、20：1三種不同比例進行感染，結果顯示毛蚴感染的比例為10：1時，釘螺陽性感染率最高。
3結語
1.VT的臨床特點及診斷技術：VT常起始于脛靜脈或比目魚肌的肌內靜脈竇，且往往多發，易脫落至靜脈，股靜脈及下腔靜脈內，因多數栓子體積甚小，甚至脫落至肺動脈內亦無任何臨床表現，而易被忽略，但如無防治則長期反復脫落栓塞至肺動脈，血栓機化后便形成慢性肺動脈栓塞，引起栓塞性肺動脈高壓、肺心病，治療棘手，預后較差。而在臨床上，常引起我們注意的是一些有明顯臨床表現的下肢深靜脈血栓栓塞，因其栓子較大，如連續幾塊栓子脫落栓塞于段以上的肺動脈則可引起致命性的臨件發生，至少可在短時間內引起心肺功能惡化。但實際上前者發病率遠高于后者。須指出很多患者雖因原發疾病而死亡，但慢性肺動脈栓塞常是使原發疾病難以糾正的重要原因。
臨床常用VT檢測手段包括下肢靜脈阻抗容積圖法、X線靜脈造影及同位素靜脈顯像等，但目前便攜式靜脈彩色超聲多譜勒儀因其方便、無創及靈敏度、特異性高而最受推崇，可應用于人群普查，為研究VT單位的必備設備。
2.明確VT與PE的關系：必須強調，VT是PE發生的標識。嚴格定義，PE是靜脈系統（含右心）血栓形成后，在環境因素作用下脫落并栓塞于肺動脈而引起一系列病理生理變化的臨床綜合征，所以靜脈血栓是PE的源頭，而控制VT是防治PE的根本所在。
為了進一步闡明二者之間關系，國外已有通過尸檢而確認PE栓子靜脈來源的研究，其中歐洲的一組研究結果為：單個栓子來源排序分別是下肢靜脈（52.7%）、盆腔靜脈叢（32.1%）、右心（13.7%）、上肢靜脈（1.5%）；多個栓子來源排序分別是下肢靜脈和盆腔靜脈叢（36.2%）、不同下肢靜脈組合（31.9%）、下肢靜脈和右心（10.6%）、盆腔靜脈叢和右心（10.6%）；19%來源不詳［1］。我國目前尚無此方面的報道，建議有條件的醫院可以聯合起來匯集尸檢資料，分析我國PE栓子的來源靜脈，對于國人PE防治有積極意義。
3.VT的危險因素：目前公認VT的危險因素分為遺傳因素和環境因素兩部分。
環境因素包括：年齡＞40歲、長期臥床、腫瘤、胸腹盆腔下肢或骨科手術、肥胖、靜脈曲張、心力衰竭、心肌梗塞或腦卒中、糖尿病、骨折、炎癥性腸病、腎病綜合征、長期留置中心靜脈導管、口服避孕藥等［2，3］。
遺傳因素目前是研究VT的熱門領域，同樣骨折或手術后患者，臥床時間相同，有的患者發生PE而有的患者未發生，原因既在于此。目前認為至少有12種基因參與，本文作者亦對此有較為詳細的綜述［4］。須著重強調的是活化的蛋白C抵抗即FVleiden，是目前最為肯定也是最常見的VT遺傳危險因子，是V因子基因單點錯意突變，即其基因核甘酸序列中1691位鳥嘌呤被腺嘌呤替代，導致其氨基酸序列中第506位精氨酸被谷酰氨代替［5］。但其與國人VT的關系，尚不清楚。目前雖可見在國人VT患者血中檢測到FVleiden的報道，但僅一例，并不能說明其發生頻率。
4.國人VT研究現狀：目前我國匱乏大樣本、正規的VT及PE的流行病學資料。最近雖有幾組關于發病情況的報道也多是其醫院內局域統計資料，對于人群防治價值有限。而血栓性疾病發病的地區、人種差異很大，不能完全引用國外的流行病學資料，尚有待我國國人資料的總結。令人鼓舞的是我院程顯聲教授領銜的“九五”攻關課題“肺栓塞的早期防治研究”已將VT的流行病學研究列為重要的分支課題，調查資料有望發表，將為國人VT的防治提供極為有價值的基線資料。
另外，國內研究VT者多為血液科醫師與研究人員，規模較小，成果受限。因PE是一跨學科疾病，應學習國外模式，聯合肺科、心臟科、血管外科、流行病學家、社區全科醫師等，形成正規研究團體，才可能對國人VT與PE防治作出有意義的工作。
5.VT的預防措施：根據國外經驗，常用的VT預防措施有以下幾種：(1)目前推薦最有效的預防措施為在以上提到的高危人群中應用低分子量肝素或普通肝素。有報道可使VT發生率由25%降為8%，使大塊PE發生率降低50%［6，7］。(2)間歇空氣加壓：在高危患者的下肢用氣壓袖帶每分鐘加壓35～40mmHg×10s(1mmHg=0.133kPa)，目前認為可以減少靜脈血栓的形成［6］。(3)有人推薦使用彈性襪預防VT，但無流行病學資料證實其有效性。(4)右旋糖苷：其預防VT發生不如肝素有效，但可進一步阻止VT的發展而減少PE［6，8］，其作用機制可能是阻止血栓進一步增大和脫落［9］。(5)阿司匹林：曾有研究否認了阿司匹林對VT的預防作用，但最近一項較大規模臨床試驗證實其可使VT發生率較對照組減少37%，PE發生減少71%［10］。且阿司匹林使用方便，價格便宜，適合各級醫師包括初級保健醫師、農村醫師使用。(6)華法令雖然有效，但監測煩瑣，作用時間較難控制，不推薦常規使用。
6.VT預防工作尚未廣泛開展的原因：在美國，96%的外科醫師都同意在術中、術后廣泛使用各種措施預防VT［6］，而在國內尚未廣泛開展，其原因有以下幾條：(1)誤以為發生率低；(2)恐懼出血的副作用；(3)擔憂醫療費用增加（沒有計算治療PE的高額費用）；(4)感知困難：出血令人難忘，抗凝的益處卻很難直接感知；(5)對發生的后果估計不足。這提示我們需要加強宣傳，提高全體醫師包括縣級基層醫院醫師防治VT的意識。
VT的研究與防治在我國是一項很重要的衛生保健任務。總體來說，目前我國相關研究與國外相比，差距很大，僅有零星個案報道，急需組織一支由多學科研究人員共同組成的專業研究團體，專門從事其臨床研究工作，爭取從分子遺傳學、遺傳流行病學、人群篩查技術、初級及二級預防措施的推廣等多方面有所突破，從而為總體降低PE的發生打下基礎。
參考文獻
［1］Kosjerina-Ostricv,KosjerinaZ,SekerovicM,etal.Pulmonarythromboembolismasacauseofdeath.eurRespirJ,1998,12Suppl28:s5.
［2］LoweGDO,GreerIA,CookeTG,etal.Riskofandprophylaxisforvenousthromboembolisminhospitalpatients.BMJ,1992,305:567-574.
［3］VerstraeteM.Prophylaxisofvenousthromboembolism.BMJ,1997,314:123-125.
［4］荊志成,程顯聲.靜脈血栓形成的分子遺傳學研究進展.中華內科雜志,1999,38:419-421.
［5］BertinaRM.MutationinbloodcoagulationfactorVassociatedwithresistancetoactivatedproteinC.Nature，1994，369:64-66.
［6］ClagettGP,ReischJS.Preventionofvenousthromboembolismingeneralsurgicalpatients.AnnSurg，1988，208:227-240.
［7］CollinsR,SerimgeourA,YusufS,etal.Reductioninfatalpulmonaryembolismandvenousthrombosisbyperioperativeadministrationofsubcutaneousheparin.NEnglJMed，1988，318:1162-1173.
［8］GruberUF,DuckertF,FridrichR,etal.Preventionofpostoperativethromboembolismbydextran40,lowdosesofheparin,orxantinolnicotinate.lancet，1977，1:207-210.
關鍵詞：妊娠高血壓疾病 發病學 研究進展
中圖分類號：R711 文獻標識碼：A 文章編號：1004-7484（2012）10-0222-03
母親安全、兒童優先是圍生醫學永恒的主題。該主題的初級目標是降低孕產婦和圍生兒死亡率，中期目標是降低母嬰發病率和殘疾率，終期目標是提高人口素質[1]。
妊娠期高血壓疾病的發病學及機制的不清目前仍然困擾著全球產科。由該病引起的孕產婦及圍生兒的死亡率和并發癥也一直威脅著女性健康。由于現代實驗方法的進步，在研究過程中發現了很多與妊娠高血壓疾病的發生、發展相關的因子，從而建立了許多學說，本文從以下幾個方面來綜述：
1 發病學研究的概述
盡管妊娠高血壓疾病的病因研究已有100多年的歷史，通過無數學者不懈的努力但至今仍未很清楚的闡明。其病理生理學改變廣泛而復雜，包括全身血管痙攣、凝血系統的激活及止血機制異常，前列環素與血栓素比值的改變等。這些異常的改變導致多器官系統血管的病理損害（如腎、肝、心、腦及子宮胎盤血管床），結果可引起胎兒生長遲緩、死胎、早產、圍產期窒息，孕婦也容易并發胎盤早剝、抽搐、顱內出血、肺水腫及肝腎功能衰竭等。近年來，隨著醫學基礎理論特別是分子生物學的研究進展，使妊娠高血壓疾病從發病學的研究到病理生理變化取得了新的突破。
2 發病學研究的機制與學說
2.1胎盤或滋養葉細胞缺血學說：
早在1918年，Young首先提出子宮缺血學說，其支持理由在于妊娠高血壓疾病多發生于：（1）子宮內壓增高的患者；（2）合并有全身血管病變的孕婦；（3）先天性動脈發育畸形的患者。以后通過許多學者的實驗證明，子宮—胎盤缺血學說獲得公認。后來又從葡萄胎可并發妊娠高血壓疾病的現實得到啟示，胎盤缺血關鍵可能在于滋養葉細胞缺血。
滋養葉細胞缺血與早孕期子宮胎盤血管床發育受阻有關。提示早孕期滋養葉細胞缺氧，可能是導致子宮胎盤血管床發育受阻的重要原因。目前又稱這種病理現象為胎盤淺表著床或缺陷胎盤。
2.2高同型半胱氨酸血癥與血管內皮損傷學說：
近年來，動物試驗證實，高同型半胱氨酸血癥可誘發孕鼠產生妊娠期高血壓疾病的典型改變[2]。因此，目前高同型半胱氨酸是妊娠期高血壓疾病發病學研究的熱點。高同型半胱氨酸可能導致妊娠期高血壓疾病的機制：高同型半胱氨酸促進氧自由基的生成，使氧化還原系統平衡失調，呈現氧化應激狀態，導致血管內皮細胞受損，繼而引發小動脈痙攣等一系列病理生理改變，符合妊娠期高血壓疾病的發病機制[3]，動物試驗通過給予蛋氨酸負荷至Wistar大鼠形成高同型半胱氨酸動物模型顯示，血漿一氧化氮濃度較試驗前明顯降低，證實了高同型半胱氨酸血癥對血管內皮功能的損害作用[4]。高濃度的同型半胱氨酸及其產生的過氧化物超過了細胞的清除能力，破環了細胞的防御性保護反應,導致內皮細胞損傷。實驗研究發現高同型半胱氨酸血管內皮損傷的特殊標志物：血管內皮損傷因子[5]，血管細胞粘附因子21，纖維結合素[6]，均生成增加[7]。研究還表明，早發型重度子癇前期患者血清同型半胱氨酸顯著高于晚發型重度子癇前期組及正常妊娠組[8]。所以，研究證明了高同型半胱氨酸在妊娠期高血壓疾病內皮細胞損傷中起著很重要的作用。目前認為，血管內皮具有多種重要的生理功能。一旦血管內皮受損可導致血管通透性增加，體液與旦白升高，抗凝血因子和血管擴張因子減少，在受損部位引發促凝血因子合成和激活凝血系統，最終導致血小板凝聚及血栓形成并釋放有絲分裂元，其中主要的有血小板衍生生長因子，這是一種很強的血管收縮因子。因此，血管內皮損傷是目前提出普遍公認的妊娠高血壓疾病的主要發病機理。
2.3免疫學說：
從免疫學角度看來，胚胎是一半同種異體移植物，妊娠成功有賴于胎兒——母親間的免疫平衡，而這種平衡一旦失調，就可能引發排斥反應，導致病理妊娠，如妊娠高血壓疾病。目前支持妊娠高血壓疾病與排斥反應有關的證據主要是，患者子宮螺旋小動脈存在著類似于腎移植排斥反應所出現的典型的血管炎病變，即螺旋小動脈急性粥樣硬化。這一點為過去和近年來國內外研究反復證實。
2.4遺傳學說：
從臨床觀察，妊娠高血壓疾病存在著明顯的遺傳傾向，即有妊娠高血壓疾病家族史的孕婦，妊娠高血壓疾病發病率明顯高于無家族史的孕婦。
從分子學水平對本病進行探討發現，采用血清學方法檢測，妊娠高血壓疾病患者白細胞抗原（HRA）DR4頻率明顯增高。PCR和地高辛標記寡核苷酸探針雜交技術，探查H41—DRB1基因座位，也證實妊娠高血壓疾病HLA—DR4抗原頻率增高和母親、胎兒HLA—DR4抗原相容性增加有關，同時還發現等位基因0405基因頻率也明顯增加。這些表明，妊娠高血壓疾病至少與HLA—DR4相關。妊娠高血壓疾病分子遺傳學的研究，還有待深入。
關鍵詞 番木瓜；遺傳改良；研究進展
番木瓜屬番木瓜科多年生常綠小喬木，是熱帶、亞熱帶地區廣泛栽培的熱帶名果之一，在我國約有70多年的栽培歷史。目前，番木瓜的種植模式、病害控制和種苗生產等問題仍是番木瓜種植和推廣的主要障礙。近50年來，離體培養、雜交育種、人工誘變育種、基因工程等現代遺傳育種學及生物技術的發展，為解決這些難題提供了新的途徑。筆者就生物技術及各育種手段在番木瓜研究中的應用進行綜述。
1番木瓜的離體培養
離體培養就是利用體細胞進行無性繁殖的一種方法。在離體培養中外植體的選擇相當廣泛，根、葉柄、莖段、子葉、胚珠、幼胚等都被相繼用來進行不同目的的離體培養研究。目前，國外已經有許多關于番木瓜離體繁殖體系、體細胞胚胎和器官發生、芽體繁殖、細胞原生質體培養等方面的報道。例如早在1978年，Litz[1]等用花藥懸浮液體培養誘導番木瓜單倍體獲得了0.1%的再生頻率，證實利用花藥或花粉培養番木瓜單倍體是可行的。Fredah[2]等通過花藥培養誘導番木瓜胚的形成，結果發現花藥培養得到的番木瓜植株絕大部分是雌性株，可用以繁殖雌性的番木瓜。1974年，DeBruijne[3]等首次報道了以番木瓜的葉柄誘導形成愈傷組織，并產生了體細胞胚，但未報道體細胞胚是否培養出小植株。Litz等人在1977年[4]，用番木瓜的莖尖和葉柄在MS和White培養基上獲得了試管株系；1982年[5]，他們又從胚珠產生的愈傷組織誘導產生體細胞胚并獲得再生植株；1983年[6]，他們通過培養番木瓜胚珠獲得了大量體胚并長成苗。1987年[7-8]，Drew和Chen等也分別從根外植體誘導產生體細胞胚和再生植株。此外，Fitch等[9-10]分別以幼胚、下胚軸為外植體誘導產生了體細胞胚，并實現了植株再生。
近年來，隨著組織培養技術的迅速發展及其與分子生物學各學科領域交叉結合的發展，國內也有不少學者對番木瓜的離體培養進行了研究。如葉克難等[11]以根、莖為外植體進行懸浮培養后，獲得了大量體細胞胚產生的再生植株；朱西儒等[12]以葉為外植體誘導產生了胚性愈傷組織并獲得再生植株；曾繼吾等[13]以子葉和幼胚2種不同的外植體誘導產生愈傷組織，結果2種來源的愈傷組織均能誘導成胚性愈傷組織并形成完整的植株，而且體細胞胚的發生率決定于外植體和培養基的激素成分。此外，鄒韻霞等[14]報道，在番木瓜受精胚珠誘導體細胞胚發生的過程中，NAA+BA+GA3組合誘導效果最佳，能獲得理想的胚性愈傷組織和體細胞胚。林治良等[15]和周鵬等[16-17]以番木瓜側芽作為外植體，分別在MS和BM培養基上建立了試管離體繁殖體系。蔡英卿等[18]報道了外植體、糖類、激素、有機物、光照等因素對番木瓜體胚誘導的影響。
2番木瓜的雜交育種
雜交育種是在各種糧食作物、經濟作物、水果蔬菜等作物上應用廣泛且取得了良好成效的常規育種手段之一。在番木瓜的雜交育種中，國內外已選育出許多優良的栽培品種[19]，如廣州市果樹研究所先后選育出穗中紅、美中紅、優8等優良品種[20]。但一直以來，番木瓜病毒病是限制番木瓜大面積種植和發展利用的最大因素之一，在已報道的近10種番木瓜病毒病中，番木瓜環斑?。≒RV）危害最嚴重。除了報道的少數抗PRV的雜交種和僅有的3種抗PRV的野生種（莖花番木瓜、托葉番木瓜和有毛山番木瓜）外，幾乎所有的番木瓜栽培品種都不能抵抗PRV的危害[21]。但由于這3種野生種不僅不能食用，而且與C.papaya存在不同程度的雜交不親和性，這無疑給番木瓜的雜交育種工作帶來了困難，難以很好地利用天然抗PRV的基因。
近年來，番木瓜實驗胚胎學、酶學等研究的不斷發展，已有一些學者成功地獲得了一些有利的雜交品種。如夏威夷大學的Manshardt和Wenslaff[22]在雜交試驗中，以3個C.papaya株系（Kapaho、Hawaii和Washington）和2個C.caulofora株系（UH345和UH372）為親本，全部組合的種間互交后，結果只有UH345為母本的組合能夠產生發育成熟的合子胚。Moore等[23]通過同工酶和PAGE檢測得到源于C.papaya×C.caulofora雜種胚性愈傷組織的體細胞植株，經過分析其相應的染色圖譜，確定該體細胞胚再生植株是種間雜種的后代。后來，Chen等[24]在實驗中也證實了C.papaya×C.caulofora雜種胚的再生植株具有種間雜種的真實性。朱西儒等[25]在番木瓜雜交育種實驗中獲得了2個較好的雜交組合，雜交后代的抗病性有所提高。黃建昌等[21]也通過輪回選擇方式，用多個組合進行種內雜交，獲得抗病性較強的雜交后代。
3番木瓜的基因工程育種
長期以來，番木瓜都面臨著病毒病的危害，尤其是PRV，但由于傳統防治方法有著諸多的缺陷，防治效果并不理想。利用基因工程進行抗病品種的培育是防治和治理病毒病的根本途徑。目前番木瓜基因工程育種主要采取2種策略：一是直接分離克隆抗PRV基因，將之轉入番木瓜基因組中，使之獲得抗性；二是將PRV病毒外殼蛋白或核酸酶基因轉入番木瓜中，使之獲得抗性[26]。1990年，Fitch等[9]建立了以番木瓜胚性愈傷組織為受體的共培養轉化體系，并通過體細胞胚發生獲得了2株表達HA5-1的轉基因植株，進一步的繁殖擴增成為2個品系。1992年，Fitch等[27]用基因槍法把構建在PG482GG的HA5-1CP的嵌合基因導入番木瓜，獲得5個轉基因品系，其中1個品系為高抗PRV株系，在田間種植2a都不發病。我國學者[28-29]通過酶聯吸附免疫、點雜交等分子遺傳學手段，也先后得到轉番木瓜環斑病毒外殼蛋白基因（PRAC-CP）植株及轉環斑病毒外殼蛋白基因和核酸酶基因（PRSV-CP-SN）植株。葉長明等[30-31]首次將PRV復制酶（RP）突變體基因導入番木瓜獲得轉基因抗病品系；隨后，葉長明等[32]通過對RP基因分析，證實了轉PRV RP基因番木瓜對PRV抗性達到高抗或免疫，RP基因可穩定遺傳并在RNA水平上表達。Tennant等[33]發現轉基因番木瓜Rainbow和Sunup都抗夏威夷品種PRSV的分離物。Chiang等[34]構建了一系列重組PRSV來接種轉PRSV-CP基因的Rainbow，結果表明，要獲得抗PRSV不同株系的廣譜抗性的轉基因番木瓜，在構建時應包括CP基因的完整編碼區及3′非編碼區。此外，還有眾多學者也開展了番木瓜轉基因的研究[35-38]。
除了對番木瓜病毒病的轉基因研究外，還有一些學者利用分子生物學的方法對番木瓜進行了性別的鑒定以及遺傳變異的研究。Sonsri等[39]用DNA擴增指紋（DAF）技術對番木瓜性別基因標記進行了研究，雖然找到了多個性別相關的標記，但未進行遺傳連鎖分析。Sordur等[40]也曾用RAPD技術構建了1個番木瓜遺傳連鎖圖譜，其中在性別決定座位兩邊各有1個標記，但遺傳距離為7cm。周國輝等[41]應用BSA法確立了2個與番木瓜兩性基因緊密連鎖的RAPD標記，它們與兩性基因的遺傳距離分別為4.5cm和1.9cm，為番木瓜性別基因的精細定位和克隆打下了良好的基礎。陳中海等[42]在實驗中，應用同工酶（POD、EST、PPO）、蛋白質的SDS-PAGE以及RAPD標記三方面研究番木瓜雌株、雄株和兩性株之間的差異，結果表明以上標記均可較準確地鑒別出番木瓜的雌、雄株，可作為對番木瓜進行性別鑒定的參考。Kim等[43]通過AFLP標記揭示了C.papaya的遺傳多樣性，該結果表明異花授粉的雌雄同體植株具有類似異花授粉雌雄異體植株的變異性；C.papaya與其余6個栽培品種也具有少量的遺傳相似性，其平均值為0.432；而6個栽培品種間的遺傳相似性的平均值則可達0.729，由此可推測，C.papaya可能是由其余6個品種早期的基因進化而來的。
4問題與展望
盡管番木瓜遺傳改良的各方面都取得了一些進展，但在實際生產上仍有許多問題，如抗病、抗寒、優質及其穩定性等未得到根本的解決。因此，利用目前組織培養技術及分子生物學等學科領域的發展技術，不僅可以從分子水平上認識這些問題，而且還可以通過各種手段來生產經遺傳改良的番木瓜品種。如選育能廣泛栽培的抗寒品種，通過可能的育種手段改善果實風味；運用基因工程技術引入外源基因，將可以有目的地提高其抗性以及調控果實代謝的相關過程，解決番木瓜果實后熟迅速、易損傷腐爛、不耐貯藏的缺陷。也曾有學者報道，雌雄異株、株性高度雜合、對病毒敏感是制約番木瓜遺傳改良的三大客觀因素。這些不利因素給番木瓜的大面積種植和雜交育種的后代選擇及性狀穩定帶來了困難，因此采用組織培養技術繁殖具有優良性狀及抗病基因型的品種是克服番木瓜實生苗后代變異、植株感病以及生產大量優質種苗的好方法。在印度和我國臺灣，這種方法已得到系統研究和生產驗證。
目前國內外許多育種學家正努力通過分子標記技術來對番木瓜的基因進行探查，對番木瓜的遺傳基礎及遺傳規律的認識正在逐步加深。實驗胚胎學、細胞遺傳學、形態解剖學及組織培養技術的不斷發展，使得遠緣雜交育種獲得雜種后代，從遠緣品種中導入抗病基因成為可能；同時，通過人工誘變技術獲得抗性突變體也是一條較理想的育種途徑。此外，基因工程技術的應用也可以進一步導入抗病基因及其他有用的基因。可以預見，隨著現代生物技術和信息技術手段的發展及廣泛應用，番木瓜的遺傳改良將會取得更大的突破，從而對促進番木瓜的長足發展具有重要意義。
5參考文獻
[1] LICA R.E，CONOVER R.A.In vitro propagation of papaya[J].Hort Science，1978（13）：241-242.
[2] FREDAH K，RIMBERIA，HARUKI S，et al.Embryo induction via anther culture in papaya and sex analysis of the derived plantlets[J].Hort Science，2005（103）：199-208.
[3] DE BRUIJNE E，DE LANGHE E，et al.Action of hormones and embryoid formation in callus of Carica papaya[J].Int.Symp.Fytofarm.Fytiat，1974（26）：637-645.
[4] LICZ R.E，CONOVER R.A.Tissue culture propagation of papaya[J].Proc.Fla.State.Hort.Soc，1977（90）：245-246.
[5] LICZ R.E.In bitro somatic embryogenesis and plant regeneration from Carica papaya L.ovular[J].Plant Sci.Lett，1982（26）：153-158.
[6] LICZ R.E，CONOVER R.A.High frequency somatic embryogenesis from Carica suspension cultures[J].Ann，Bot，1983（51）：683-686.
[7] DREW R.A.The effects of medium composition and conditions on in vitro initiation and growth of papaya （Carica papaya L）[J].Hort，Sci，1987：551-556.
[8] CHEN M.H.Somatic embryogenesis and plant regeneration in Carica papaya L.tissue culture derived form root explants[J].Plant Cell Reports，1987（6）：348-351.
[9] FITCH M.M.M，MANSHARDT R.M.Somatic enbryogenesis and plant regeneration from immature zygotic embryos of papaya（Carica papaya L.）[J].Plant Cell Reports，1990（9）：320-324.
[10] FITCH M.M.M.High frequency somatic embryogenesis and plant regeneration from papaya hypocotyls callus[J].Plant Cell Tissus Organ Culture，1993（9）：189-194.
[11] 葉克難，馬蕾.番木瓜懸浮培養的體胚發生和植株再生[J].植物學報，1991，33（7）：565-568.
[12] 朱西儒，張云開.番木瓜葉片愈傷組織形成、分化及再生植株移栽[J].廣西植物，2001，21（1）：59-62.
[13] 曾繼吾，易干軍，張秋明.番木瓜體胚發生及植株再生研究[J].果樹學報，2003，20（6）：471-474.
[14] 鄒韻霞，郭惠珊.番木瓜胚珠高頻率體胚發生和植株再生[J].中山大學學報（自然科學版），1992，31（3）：60-65.
[15] 林治良，王長春，林瀚，等.番木瓜的離體培養快速繁殖[J].福建農業大學學報，1996，25（2）：165-167.
[16] 周鵬，鄭學勤，曾憲松.番木瓜快繁技術的研究[J].熱帶作物研究，1992（1）：51-57.
[17] 周鵬，鄭學勤，陳向民.成齡番木瓜的快繁技術[J].熱帶作物學報，1995，16（2）：66-69.
[18] 蔡英卿，賴鐘雄.番木瓜生物技術研究進展[J].江西農業大學學報，2003，25（3）：429-434.
[19] CONVER R.A，Litz R.E.Progress in breeding papaya with tolerance to papaya ringspot virus[J].Pro Fla Hort Sci，1997，91（1）：182-184.
[20] 黃建昌，肖艷，趙春香.番木瓜遺傳改良研究進展[J].果樹學報，2005， 22（1）：60-65.
[21] 黃建昌，肖艷.抗環斑型花葉病毒病番木瓜新品種選育研究初報[C].廣東遺傳學研究，2004：25-28.
[22] MANSHARDT R.M，WENSLAFF T.F.Zygotic polyembryony in interspecifci hybrids of Carica papaya and C.cauliflora[J].J.Amer.Soc.Hort.Sci，1989，114（4）：684-689.
[23] MOORE G.A，LITZ R.E.Biochemical mabers for Carica papaya，C.Caulifora，and plants from somatic embryos of their hybrid[J].Amer Soc Hort Sci，1984，109（2）：213-218.
[24] CHEN M.H，CHEN C.C.Plant regeneration from Carica protoplasts[J].Plant Cell Reports，1992（11）：404-407.
[25] 朱西儒，張云開，張海保，等.番木瓜雜交果籽與發芽及F1代的環斑花葉病調查研究[J].廣西熱作科技，1999（2）：5-8.
[26] 郭得章，鄢錚，林慶良，等.番木瓜組織細胞學及遺傳改良研究進展和展望[J].福建農業學報，2001，16（2）：49-55.
[27] FITCH M.M，MANSHARDT R.M，et al.Virus resistant papaya plants deribed from tissoes bombarded with the CP gene of PRV[J].Bio Technology，1992（10）：1466-1472.
[28] 周鵬，鄭學勤，陳向民，等.轉基因番木瓜小規模田間攻毒試驗[J].熱帶作物學報，1997，18（1）：58-62.
[29] 周鵬，鄭學勤.PRSV-CP轉基因番木瓜表達與抗病能力的研究[J].熱帶作物學報，1996，17（2）：84-87.
[30] 葉長明，陳谷，黃俊潮，等.番木瓜環斑病毒復制酶基因的克隆和序列分析[J].中山大學學報（自然科學版），1996，35（6）：125-127.
[31] 陳谷，葉長明，黃俊潮，等.番木瓜環斑病毒復制酶基因轉化番木瓜的研究[J].遺傳，1998，20（Z）：9-11.
[32] 葉長明，魏祥東，陳東紅，等.轉基因番木瓜的抗病性及分子鑒定[J].遺傳，2003，25（2）：181-184.
[33] TENNANT P，FERMIN G，et al.Papaya ringspot virus resistance of transgenic rainbow and sunup is affected by gene doeage，plant debelopment and coat protein homology[J].European Journal of Plant Pathology，2001（107）：645-653.
[34] CHIANG C.H，WANG J.J，et parative reactions of recombinant papaya ringspot viruses with chimeric caot protein（CP）genes and wild-type virusea on CP-transgenic papaya[J].Journal of General Virology，2001（82）：2827-2836.
[35] CHENG Y.H，YANG J.S，et al.Efficient transformation of papaya by coat protein gene of papaya ringspot virus mediated by Agrobacterium following liquid-phase wounding of embryogenic tissues with caborundum[J].Plant Cell Report，1996(16)：127-132.
[36] GONSALVES C，CAI W.Q，et al.Effective development of papaya ringspot virus resistant papaya with untranslatable coat protein gene using a modified microprojectile tranaformation method[J].Acta Hort，1998（461）：311-314.
[37] ROSEMARIE E.L，DENIS P，et al.Genetically engineered immunity to papaya ringspot virus in Australian papaya cultures[J].Molecular Breeding，2002（10）：119-129.
[38] BAU H.J，CHENG Y.H，et al.Broad spectrum resistance to different geographic strains of papaya ringspot virus in coat protein gene transgenic papaya[J].Phytopathology，2003，93（1）：112-120.
[39] SONSRI S，DREW R，et al.Developing molecular makers for sex predicti on papaya （Carica papaya L.）[J].Acta a Hort，1998（461）：141-148.
[40] SONDUR S.N，MANSHARDT，et al.A genetic in Kage map of papaya basedon randomly amplifie polymorphi cDNA markers[J].Theor Appl Genet，1996（93）：547-553.
[41] 周國輝，李華平，光，等.番木瓜兩性基因的RAPD標記[J].熱帶亞熱帶植物學報，2001，9（3）：190-193.
胰腺癌是發展迅速且預后不良的惡性腫瘤,手術切除率較低,術后復發率高,對化療不敏感,目前尚無理想療方法。隨著分子遺傳學和基因工程技術的飛速發展,基因治療逐漸開始應用于臨床疾病的研究,近年對自殺基因在腫瘤治療中的作用研究頗多，本文就胰腺癌自殺基因療法研究的新進展做一綜述。
一、 自殺基因治療
將自殺基因轉導入腫瘤細胞,再用相應的藥物前體或細胞毒因子,前者通過自殺基因編碼的特異性酶類將無毒的藥物前體在腫瘤細胞內代謝成毒性產物或細胞毒因子與其受體結合,從而達到殺死腫瘤細胞的目的,以前又稱為腫瘤的藥物基因治療,也有稱為病毒介導的酶解藥物前體療法(vius directed enzyme prodrug therapy,VDEPT)［1］
二、 自殺基因治療的作用機制
代謝產物的直接毒性作用 通過分子生物學技術將自殺基因轉導至腫瘤細胞中,然后全身或局部注射無毒、低毒的前體化療藥物,由于腫瘤組織中表達“自殺”基因,編碼酶將前體化療藥物轉化為具有殺腫瘤作用的毒性代謝產物,在腫瘤局部形成一個藥物濃聚區,可以增強療效,并減弱化療藥物的全身毒副作用,達到選擇性殺傷腫瘤的目的。
三、 胰腺癌的自殺基因幾種治療模型
(一) 單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因及其底物丙氧鳥苷丙氧鳥苷HSV TK基因/GCV HSV
CD基因編碼的胞嘧啶脫氨酶,可將胞嘧啶代謝為尿嘧啶,使5-Fc轉化為細胞毒性代謝產物5-Fu,從而發揮細胞毒作用。TK基因治療胰腺癌是通過這種基因編碼的胸苷激酶特異地將核苷類似物藥物前體,如羥甲基無環鳥苷(Ganciclovir,GCV)磷酸化,進而在細胞進一步代謝成三磷酸GCV,后者可抑制細胞DNA聚合酶的功能或競爭性地滲入細胞DNA造成DNA合成終止使細胞死亡。
近年來,HSV TK基因較廣泛地應用于胰腺癌治療研究中,Block A等［3］用HSV TK基因/GCV治療胰腺癌肝轉移動物模型,結果體外生長的胰腺癌細胞高效表達HSV TK基因,并顯示了“旁觀者效應”;荷瘤鼠瘤內注射HSV TK,繼之使用GCV 8天,肝轉移瘤明顯縮小、壞死。顯示了HSV TK基因殺傷胰腺癌細胞的作用。。Aoki K［4］在HSV TK基因下游加上一個雜交的強啟動子CAG,結果14只荷瘤鼠中8只腫塊消失,其余6只鼠瘤塊明顯縮小,而24只對照鼠腫塊無變化,且該研究治療中,未發現任何毒性反應?；蛑委煹陌邢蛐允顷P系到基因治療的效果問題之一。
（二） EC CD基因/5 FC
EC CD基因可將無毒性的藥物前體5 氟胞嘧啶(5 Fuorocytosine,5-FC)代謝成抗DNA合成的化療藥5-Fu,使腫瘤局部藥物濃度增加,達到殺死腫瘤細胞,減輕毒性作用的目的,Autin等最早分離、克隆編碼了EC CD基因,并用逆轉錄病毒介導轉染結腸癌細胞,結果轉導的腫瘤細胞被殺傷。Evoy D等，將該方法用于胰腺癌的治療研究,表明了EC CD/5 FC的抗腫瘤作用。同樣也觀察到“旁觀者效應”使抗腫瘤作用加強。
四、 聯合基因治療
（一） 聯合抑癌基因治療 融合自殺基因治療是利用基因工程技術將自殺基因和另一種基因連接在一起,以增強自殺基因治療腫瘤的效果。
P 53是一種抑癌基因, Cascallom等發現,野生型P53基因轉導能增強吉西他濱和順鉑對胰腺癌細胞的化療效果,Mercade等以實驗表明P53基因轉導對自殺基因治療療效的增強作用,估計與P53能夠識別破壞的DNA,增強化療對腫瘤的抑制作用有關。
轉染雙自殺基因至SW1990細胞在體外實驗治療中取得了較好的效果,但在體內的應用還有很多局限性,而且有資料顯示胰腺癌細胞對于許多化療藥物存在固有不敏感性.
（二） 聯合細胞因子基因治療 轉移細胞因子基因可以誘發機體強大的抗腫瘤免疫,其中IL18基因作用較突出。CD基因和IL18基因聯合轉移后,可以協同發揮抗腫瘤作用,克服兩者單獨使用的不足之處,提高機體對腫瘤的細胞免疫應答,增加機體的非特異性和特異性抗腫瘤作用。
某些細胞因子對惡性腫瘤有殺傷作用,目前已有關于聯合自殺基因與細胞因子基因治療的報道,Judw等在大腸癌細胞的CD/5 Fc治療模型中,轉染淋巴肌動蛋白基因進入瘤細胞,發現可以增強機體抗腫瘤免疫應答,增加自殺基因的療效;SakaiY等在肝細胞癌的HSV tk/GCV治療模型中,輔以單核趨化蛋白 1基因治療,同樣增強了GCV的療效。目前胰腺癌中此項研究尚無報道。
五、 總結
綜上所述,自殺基因治療應用于胰腺癌等消化道腫瘤的輔助治療已經取得了很多成果,但要應用于胰腺癌的臨床治療則還有許多問題尚待解決,如基因治療的安全性、轉導效率還不夠高,藥物的最佳使用時間以及如何增加療效等。目前研究的重點是:(1)逐步從體外實驗向體內實驗過渡,觀察自殺基因治療對大體積腫瘤的療效;(2)解決臨床應用的安全性問題,這也是所有基因治療的共同問題。隨著研究的進一步深入,自殺基因治療必將會成為一種有效的胰腺癌輔助治療手段。
參考文獻
［1］ Mulligan RC.The basic science of gene therapy. Science .1993,260(5110);926,32.
［2］ Rosenfeld ME,Vickers SM,Roben D,etal.Pancreatic carcinoma cell killing via adenoviral mediated delivery of the herpes simplex virus thymidine kinase gene.Ann Surg,1997,225(5);609-18.
然而由于種種原因，近年來，作為衡量碩士研究生培養水平重要指標的碩士學位論文的質量卻不盡如人意。碩士研究生學位論文目標不明、內容空泛、層次不清、推理不嚴，以及答辯準備不充分的現象十分普遍。目前，如何提高研究生學位論文質量的問題已引起了各高校學者與專家們的廣泛關注。陶勇等[1]對農科專業碩士學位論文寫作中存在的問題及原因進行了全面深入的分析，認為從實驗內容到具體寫作，都存在或大或小的問題，而研究生與指導教師長期不懈的努力是逐步提高學位論文水平和研究生素質的關鍵。首都經濟貿易大學工商管理學院院長黃津孚則認為[2]要提高碩士論文的質量，必須從學風、導師和制度抓起。筆者擬就如何提高農業院校研究生學位論文質量的問題，談幾點認識。
堅持“化整為零”的原則
堅持“化整為零”的原則，即打破畢業前半年才開始著手撰寫畢業論文的傳統觀念，在入學初即告訴學生碩士學位論文寫作的一般程序和規范，幫助學生合理規劃三年的學習時間，將畢業論文化整為零的完成。督促學生從入學的第一天就要天天、月月、年年想到畢業論文的撰寫，時時處處為畢業論文的撰寫做準備。這樣既可以增加學生的緊迫感，培養學生統籌安排的能力，同時也有利于學生主動將基本理論，基本知識的學習與科研實際相結合。首先，要求學生利用課余時間，在前期基礎課學習的過程中完成大量文獻的查閱工作，在入學半年后提交所選研究方向國內外研究現狀和實驗方法的綜述，為寫好碩士畢業論文的前言、材料與方法以及參考文獻部分奠定堅實的基礎。解決學生因畢業論文撰寫時間倉促，導致質量偏低的現象。
堅持 “三早”的原則
堅持貫徹“三早”原則，也就是早選題，早定題，早開題的原則。在學生入學初，準備好一系列與導師研究相關的題目，比如：大豆油分研究；大豆蛋白質品質研究；大豆加工適應性品質研究；大豆種質開發研究；大豆基因組研究等等，供學生按照自己的愛好選擇課題，激發學生的主題意識和主動發展的愿望。督促學生盡快選定研究方向，盡早開始文獻查閱。定期給予學生指導，培養學生掌握科技文獻檢索、資料查詢與閱讀的方法和能力，同時指導學生對查閱過的文獻的題目，來源等等按照參考文獻的正規格式進行相應的詳細記錄，以備最后集中撰寫論文時，有的放矢，從而避免學生隨意堆砌參考文獻，甚至從網上下載，直接粘貼的現象。要求學生在入學半年后必須提交合格的開題報告，徹底改變學生不讀書，不了解學科動態的狀況。
堅持“步步為營、不欠賬”的原則
農業生物技術專業具有季節性強，生育周期長的特點，因此，要想保證論文的各個環節都有充分的時間得以保質保量的完成，在盡早開始進入試驗狀態的前提下，還要督促學生堅持做到“步步為營，不欠賬”，也就是要根據開題報告中工作進度計劃的安排，認真做好每一個階段的工作，比如，播種期做好播種計劃，適時播種，生育期做好各項生理指標的檢測，在秋冬季進行分子遺傳學室內分析等，對每一個階段的工作，數據要及時進行整理，總結，及時發現問題，及時解決問題，堅決杜絕將所有的原始數據堆積到最后分析。防止一旦發現問題，又沒有可能在短時間內補救，只好編造數據的現象。保證研究生如期完成學位論文的撰寫，充分準備，做好畢業論文的答辯。
三個“堅持”原則的貫徹可以全面提高學生的綜合能力和素質。對于培養富有創新精神和實踐能力的人才具有重要的意義。首先，通過督促學生查閱大量的文獻，可以解決學生不讀書，不了解學科動態的問題，同時幫助學生拓寬相關知識面；其次，通過對試驗設計、試驗實施的過程嚴把質量關，可以培養學生科學的態度及科學研究的能力，加強對研究生研究方法的教育，提高研究生的學術水平。第三，通過把好數據分析，論文撰寫及論文答辯的質量關，可以提高學生的寫作水平，信息處理能力以及語言表達能力。三個“堅持”原則的貫徹使得提高碩士研究生學位論文質量的工作落到實處，水到渠成的使學生具備了農業現代化生產所急需的創造型人才必須具備的各項基本技能。
參考文獻：
關鍵詞：食管癌 癌基因 抑癌基因
中圖分類號：R34 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2014）10（a）-0020-03
Research on the Changes of Genes in Esophageal cancer
GUAN Xuan WU Jin
（1.School of Basic Medical Sciences， Chengdu Medical College， Sichuan Chengdu ，610500， China；2. Preclinical and Forensic Medicine， Sichuan University， Sichuan Chengdu，610041，China）
Department of Forensic Biology， Sichuan University， Chengdu 610041， China Abstract The onset and development of esophageal cancer is affected by multiple factors. Functional variations of genes may be one of the most important factors. To help the readers understand the importance of oncogenes and cancer suppressor genes in the diagnosis， treatment， prognosis and prevention of esophageal cancer， this review introduces current state of knowledge about the association between genes and esophageal cancer， and the underlying mechanisms.
Key words：esophageal cancer oncogene cancer suppressor gene
食道癌是常見的消化道惡性腫瘤，死亡率居各種癌癥的第6位[1]。主要有鱗癌和腺癌兩種形式。食道癌的發生發展是一個涉及多因素、多階段、多基因變異積累及相互作用的過程[2，3]。目前研究認為，在細胞癌變過程中，癌基因的激活和抑癌基因的失活可能是細胞癌變的分子基礎，細胞凋亡相關基因和腫瘤轉移抑制基因異常等也與之有關[4]。因此，加強對食道癌特異的分子遺傳學學變化的研究，不僅有助于闡明其發生、發展的機制，而且對臨床治療也有一定的指導作用。
癌基因（oncogene）是人類或其他動物細胞（以及致癌病毒）固有的一類基因，又稱轉化基因，它們一旦活化便能促使人或動物的正常細胞發生癌變。抑癌基因（cancer suppressor genes）是指產生直接或間接抑制細胞增殖、癌變的腫瘤抑制基因，其在腫瘤的發生、治療與預后中發揮著重要作用。
癌基因和抑癌基因的研究對于食道癌的早期診斷、判斷預后、治療及預防等方面都有重要的意義，將會為食道癌的診斷與治療提供科學的分子基礎和理論依據。
1 癌基因
1.1 myc基因
myc族基因是白基因家族，為細胞內的原癌基因，基因定位于8q23，主要包括C-myc，L-myc，N-myc。較多的研究證實其表達與細胞增生、腫瘤發生、發展密切相關。Sarbia等[5]通過對食道癌發生不同階段的C-myc表達情況進行檢測，發現在重度不典型增生上皮和腺癌標本才有C-myc基因擴增現象，從而認為C-myc基因擴增在食管腺癌的發生、發展過程中是一個晚期事件。國內楊立峰[6]等研究發現，myc基因擴增率高的食道癌患者其淋巴結轉移率及外侵性顯著高于對照組，以此可以推測，myc基因過度表達的食道癌細胞預示高度惡性、侵襲、轉移率高，治療預后差。
1.2 C-erbB-2基因
C-erbB-2基因定位于17q21，最早在乙基亞硝基脲引起的大鼠神經母細胞癌株中發現，可以編碼184kU的具有酪氨酸酶活性的跨膜糖蛋白，后續研究認為其在細胞增殖和分化調控中起重要作用。Lam等[7]研究癌旁不典型增生組織及Barrett粘膜中發現C-erbB-2的基因擴增和過表達，認為這一現象可能是部分食道癌發生中的早期事件，也有研究表明其在食道癌的淋巴結轉移過程中發揮作用，提示C-erbB-2蛋白表達陽性者較陰性者更容易發生淋巴結轉移[8]，導致預后不佳。
1.3 CyclinD基因
CyclinD基因，又稱為prad1基因，位于11q13號染色體上，目前研究認為其是一種細胞周期相關癌基因。CyclinD基因可編碼CyclinD1蛋白，后者是細胞周期結構成分，G1～S轉換的關鍵周期蛋白。在食管鱗癌中常發現CyclinD1基因擴增或過表達，并與淋巴結轉移、腫瘤分期和生存率下降等相關。Roncalli[9]等研究發現，食道癌組織中存在CyclinD基因的擴增和過度表達，正常食管上皮和胃粘膜組織則無基因擴增和過度表達現象。CyclinD基因與抑癌基因Rb及p16關系密切，有研究認為cyclinD和p16在調節細胞周期活動中構成反饋調節通路[10]，并產生相互拮抗作用，兩者任一發生突變或過表達等異常均可引起調節通路障礙而表現為細胞增殖失控，細胞過度增殖并導致癌癥的發生。
1.4 MTA1基因
MTA1是新近發現的一個腫瘤浸潤轉移侯選基因，位于人染色體14q32.3，基因全長為2.2kb，編碼一個含703個氨基酸殘基的蛋白質mtal，分子量為79.4 kD，屬于核小體重構和脫乙酰基復合物（NuRD）的組成成員之一，它通過促進組蛋白脫乙?；绊懟虻霓D錄和復制，參與信號傳導和基因表達調節，與多種腫瘤組織，尤其是上皮源性惡性腫瘤組織的侵襲轉移能力密切相關[11]。Toh等[12]對47例食管鱗癌標本進行研究發現，47例樣本中有16例發生MTA1基因高表達，且與食道癌發生血管浸潤和淋巴結轉移呈正相關。王俊平等[13]研究亦發現人食管鱗癌組織MTA1蛋白表達明顯升高，MTA1與食道癌的發生發展及浸潤轉移有關。
1.5 MET基因
MET基因定位于7q31區，其編碼產物為一種190 000的酪氨酸激酶受體，是一種腫瘤轉化基因。作用機制可能為其編碼受體通過與肝細胞因子相結合，進而使酪氨酸激酶磷酸化，啟動細胞的有絲分裂，并促進細胞變形和向腺上皮的形態分化。Hu等通過對61例食管鱗狀細胞癌樣本的研究發現，發現MET的表達率高達91.8%，且與食管鱗癌的分化程度明顯相關。秦艷茹等[14]研究發現，MET在食道癌組織中的陽性率高于癌旁正常組織，食道癌轉移淋巴結組織中MET的陽性率高于癌組織，提示MET可能與食道癌不良預后和淋巴結轉移有關。
2 抑癌基因
2.1 DPC4
DPC4基因是重要的抑癌基因，定位于染色體18q21.1。其編碼蛋白Smad 4是轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）超家族受體的直接底物。在TGF-β信號轉導途徑中，DPC4與不同的Smad蛋白相互作用是信號轉導的中心環節。腫瘤DPC4基因失活，會導致Smad-TGF-β信號轉導途徑的破壞，從而失去對腫瘤細胞增殖的抑制作用[15]，因此DPC4也可被認為是一種腫瘤抑制劑[16]。
有研究應用免疫組織化學SP法檢測了174例食道癌組織和30例癌旁正常食管黏膜的DPC4基因的蛋白表達，研究顯示DPC4在癌旁正常食管黏膜和食道癌中的陽性表達率分別為80%、40.8%，二者差異有統計學意義，說明DPC4的低表達與食道癌的發生有一定的關系。研究表明，DPC4的表達缺失與組織分化有關，分化越差的惡性腫瘤，DPC4的缺失率越高[17]。
2.2 PTEN
PTEN又稱MMAC1或TEP1，是Li等[18]從原發性乳腺癌、前列腺癌以及膠質母細胞瘤細胞株克隆得到的，定位于人染色體10q23.3，是一種具有雙特異性磷酸酶活性的新型抑癌基因，也是目前惟一具有磷酸酶活性的抑癌基因，該基因可通過對PIP3脫磷酸，抑制PIP3/PKB生存信號在細胞內的轉導，誘導細胞停滯在G1期或促使細胞凋亡[19]，在腫瘤細胞浸潤、腫瘤轉移中起到一定作用[20]。而至今在食道癌研究表明，PTEN基因突變在食道癌組織中的發生頻率較低，而僅表現為蛋白表達普遍下降[21]。PTEN蛋白在正常食管鱗狀上皮和癌組織都主要表達于細胞漿內，胞核內也可見，呈棕黃色顆粒[20]。李勁松等研究顯示[22]， PTEN在食管鱗癌中的表達率明顯低于癌旁正常食管黏膜組織，差異有統計學意義。Tachibana等[23] 研究發現PTEN的表達隨著腫瘤的惡性程度升高有下調的趨勢。蔣虹等[24]研究發現，食道癌組織中PTEN表達水平明顯低于癌旁組織，呈負相關關系，且隨著食道癌的進展，其表達呈逐漸下降趨勢[25]。
2.3 DMBT1
DMBT1基因位于人類染色體10q26.13，因在髓母細胞瘤和膠質細胞瘤中廣泛缺失而得名，該基因表達產物可促進細胞的分化，發揮其抑制腫瘤發生和轉移的作用。研究表明，該基因表達下調、缺失、突變失活與多種腫瘤，特別是與上皮細胞腫瘤的發生發展、淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度存在一定相關性。張光斌[26]等研究發現DMBT1在體外的過表達會抑制食道癌細胞的侵襲，但具體機制目前還不能闡述清楚。王越英等[27]研究報道，在食道癌組織中，DMBT1mRNA陽性表達缺失率存在明顯增高，且其缺失率于淋巴結轉移和腫瘤外侵嚴重程度明顯相關。
2.4 nm23
nm23由Steeg等在1988年從K-1753鼠黑色素瘤細胞株分離出來，是腫瘤轉移抑制基因。該基因在人類定位于染色體17q21-22，全長8.5 kb。陳艷[28]等對哈薩克族食道癌樣本的研究中發現，nm23-H1低表達與腫瘤浸潤轉移高度相關，其可能機制為nm23-H1低表達導致食道癌細胞轉移表型，并改變了其生物學行為，進而與腫瘤的浸潤及淋巴轉移有關。
3 結語
總之，食道癌變是一個多階段進行性演變過程，其病因學研究涉及遺傳和環境多個方面。在其遺傳病因學研究方面，眾多的研究涉及到多種相關或獨立的基因或分子改變，并認為食道癌變是多種基因變化綜合作用的結果。但各種分子事件在食道癌腫瘤發生、發展過程中的作用比重及機制，目前尚缺乏權威數據，需要進一步研究。近年來，食道癌的遺傳學研究主要集中于尋找并研究癌變早期基因，并進一步深入探討其致癌機制，以實現食道癌的早期診斷、治療、高危人群早期檢測及生物防治，為降低食道癌的發病率和病死率提供參考或依據。食道癌基因治療的研究也形成一定的規模，有望在不久的將來實現突破。
參考文獻
[1] Pisani P， Parkin DM，Bray F，et al.Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990[J].Int J Cancer，1999，83（1）：18-29.
[2] Shen ZY，Xu LY，Li EM，et al.The multi stage process of carcinogenesis in human esophageal epithelial cells induced by human papillomavirus[J].Oncol Rep，2004，11（3）：647-654.
[3] Hu N，Wang C，Su H，et al.High frequency of CDKN2A alterations in esophageal squamous cell carcinoma from a high-risk Chinese population[J].Genes Chromosomes Cancer，2004， 39（3）：205-216.
[4] Lu SH. Alterations of oncogenes and tumor suppressor genes in esophageal cancer in China[J].Muta Res，2000，462（3）：343-345.
[5] Sarbia M， Arjumand J，Wolter M，et al.Frequent C-myc amplification in high-grade dysplasia and adenocarcinoma in Barrett esophagus[J].Amj Clin Pat hol，2001，115（6）：27.
[6] 楊立峰，王躍江，佟胄，等.myc族癌基因與食道癌相關性的研究[J].中國腫瘤臨床與康復，2000，7（5）：16-17.
[7] Lam KY， Tin L， Ma L. C-erbB-2 protein expression in oesophageal squamous epithelium from oesophageal squamous cell carcinomas，with special reference to histological grade of carcinoma and pre-invasive lesions[J].Eur J Surg Oncol，1999， 24（5）：431-435.
[8] 董向，洪豐.癌基因C-erbB-2和抑癌基因nm23-H1的表達與食道癌預后的關系[J].陜西醫學檢驗，2001，16（3）：48-49.
[9] Roncalli M，Bosati S，Mar chetti A，et al.Functional interactions of the retinoblastoma protein with mammalian D-type cyclines[J].Cell，1993，73：487.
[10] Nobori T，Miura K，Wu DJ，et al.A deletion of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancer[J].Nature，1994，368：753.
[11] Nicolson GL，Nawa A，Toh Y， et al.Tumor metastasis associated human MTA1 gene and its MTA1 protein product role in epithelial cancer cell invasion， proliferation and nuclear regulation[J].Clin Exp Metastasis，2003，20（1）：19-24.
[12] Toh Y，Kuwano H，Mori M，et al.Overexpression of metastasis-associated MTA1 mRNA in invasive oesophageal carcinomas[J].Br J Cancer.1999，79（11-12）：1723-1726.
[13] 王俊平，陳奎生.食管鱗癌組織中MTA1蛋白的表達[J].醫藥論壇雜志，2007， 28（1）：64-65.
[14] 秦艷茹，李永欣，王立東，等.食道癌和淋巴結轉移組織中c-myc，hTERT和c-MET蛋白的表達[J].鄭州大學學報：醫學版，2006，41（1）：34-36.
[15] Chen WB，Lenschow W，Tiede K，et al.Smad4/DPC4-dependent regulation of biglycan gene expression by transforming growth factor-beta in pancreatic tumor cells[J].J Biol Chem，2002，277（39）：36118-36128.
[16] Lin X，Liang M，Liang YY，Brunicardi FC，et al.Activation of transforming growth factor-beta signaling by SUMO-1 modification of tumor suppressor Smad4/DPC4[J].J Biol Chem，2003，278（21）：18714-18719.
[17] 宋文慶，陶儀聲，張洪福，等.抑癌基因DPC4 蛋白在食道癌中的表達及其意義[J].蚌埠醫學院學報，2008，33（5）：512-514.
[18] Li J，Yen C，Liaw D，et al.PTEN，a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain，breast，and prostate cancer[J].Science，1997，275（5308）： 1943-1947.
[19] Cheung SM，Kornelson JC，AlAlwan M，et al.Regulation of phosphoinositide 3-kinase signaling by oxidants：hydrogen peroxide selectively enhances immunoreceptor-induced recruitment of phosphatidy linositol（3，4） bisphosphate-binding PH domain proteins[J].Cell Signal 2007，19（5）：902-912.
[20] 霍霞，許險峰，徐錫金，等.抑癌基因PTEN在食道癌中的表達[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2003，12（4）： 339-343.
[21] Ding Y，Shim ada Y， Kano M，et al.PTEN/MMAC 1 expression in esophageal squamous cell carcinomas[J].Int J Oncol2000，17（4）：695-699.
[22] 李勁松，楊琨，王建軍.PTEN蛋白在食道癌中的表達及臨床意義[J].華中科技大學學報：醫學版，2006，35（5）：623-629.
[23] Tachibana M，Shibak ita M，Ohno S，et al.Expression and prognostic significance of PTEN product protein in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J].Cancer，2002，94（7）：1955-960.
[24] 蔣虹，徐志飛，邱秀華，等.食道癌中AKT和PTEN蛋白表達及其臨床相關性研究[J].中國腫瘤生物治療雜志，2003，10（4）：265-268.
[25] 劉瑩，林曉燕，覃業軍，等.食管鱗狀細胞癌組織PTEN 基因表達及臨床意義的探討[J].中華腫瘤防治雜志，2010，17（18）：1444-1446.
[26] 張光斌，賀濤，張寧.DMBT1過表達對食道癌細胞系EC9706生物學行為的影響[J].世界華人消化雜志，2009，17（17）： 1759-1763.
關鍵詞：原子力 顯微鏡 生物醫學 應用
1 原子力顯微鏡工作原理
原子力顯微鏡（Atomic force microscopy，AFM）是一種以物理學原理為基礎，通過掃描探針與樣品表面原子相互作用而成像的新型表面分析儀器。它屬于繼光學顯微鏡、電子顯微鏡之后的第三代顯微鏡。AFM通常利用一個很尖的探針對樣品掃描，探針固定在對探針與樣品表面作用力極敏感的微懸臂上。懸臂受力偏折會引起由激光源發出的激光束經懸臂反射后發生位移。檢測器接受反射光，最后接受信號經過計算機系統采集、處理、形成樣品表面形貌圖像。早期研制的為接觸式原子力顯微鏡，它包括恒力模式和恒高模式。前者利用反射光位移引起的光電二極管輸出電壓的變化構成反饋回路控制壓電陶瓷管伸縮，從而調節固定于掃描器上樣品的位置，保持樣品和探針間作用力（懸臂彎曲度）不變，測量每一點高度的變化。后者保持樣品和探針間的距離不變，測量每一點作用力的大小。這種模式在調節探針與樣品距離前即可直接觀測懸臂彎曲度的改變。除傳統的接觸式之外，1993年又研制出輕敲式原子力顯微鏡。該顯微鏡在掃描過程中探針與樣品表面輕輕接觸，懸臂受存在于兩者間的排斥力作用隨樣品表面起伏發生高頻振顫。由于探針與樣品的接觸短暫，因此它更適用于質地脆或固定不牢的樣品 ［1］ 。
2 原子力顯微鏡的應用
在AFM誕生最初的一段時間主要應用于電化學、材料科學等領域。近些年，人們逐漸探索著運用AFM對生物樣品進行納米水平的觀測及顯微操作等。與其它顯微鏡相比，AFM的納米量級的高空間分辨率尤為突出，橫向分辨率可達0.1～0.2nm，縱向分辨率高達0.01nm。此外，它不但能夠對生理狀態下的樣品成像，而且可以實時動態地研究樣品結構和功能的關系。故而，AFM成為納米尺度上研究物質結構、特性和相互作用的有力手段。以下主要對這項納米技術在生物醫學研究領域中取得了顯著的成績作一綜述。
2.1 形態結構 作為新興的形態結構成像技術，AFM實現了對接近自然生理條件下生物樣品的觀察。這主要由于它具備以下幾個特點:（1）與掃描電鏡和透射電鏡這些高分辨的觀測技術相比，樣品制備過程簡便，可以不需染色、包埋、電鍍、電子束的照射等處理過程;（2）除對大氣中干燥固定后樣品的觀察外，還能對液體中樣品成像;（3）可以根據觀察者的要求，調節樣品所處的溫度、濕度、大氣、真空等觀察條件。目前，AFM已廣泛地應用于細胞及蛋白、多糖、核酸等生物大分子結構的研究中。對一個細胞而言，AFM不但能夠提供長度、寬度、高度等形態方面的信息，還可以滿足人們對膜上的離子通道、絲狀偽足、細胞間連接等細微結構的研究 ［2，3］ ，甚至還可清楚地觀察到膜身的骨架結構 ［4］ 。后者對細胞表面與表面下結構相互作用的進一步研究非常有利。Qian ［5］ 等利用AFM對酵母的熱休克蛋白Sis1與Ssa1進行觀察，發現只有Ssa1的lid區一端與Sis1縮氨酸結合區作用，并且Sis1二聚體的縮氨酸結合區呈現較高水平的凹槽結構，這有助于闡明蛋白相互作用機制及其在蛋白折疊、組裝、降解、轉移中的重要作用。定的生理生化反應會引起生物樣品空間結構的變化。利用AFM對這些變化的觀察，為細胞結構及結構調節的生理意義等研究提供更多有價值的信息。例如Liu ［6］ 等將大麥的中期染色體經嚴格點干燥、2M NaCl處理后提取出2種非組蛋白。通過AFM在納米水平顯示提取蛋白后染色體的三維結構，發現處理后的染色體發生下列變化:高度降低同時表面較前粗糙。又如:Sit ［7］ 將纖維蛋白原固定在3種不同基底表面，研究樣品發生的結構變化。由AFM的三維定量分析顯示纖維蛋白原按照mica
2.2 力學特性 由于利用AFM可對掃描各點高度及作用力的測量，這就意味著我們不僅可以獲取生物樣品的表面形態和三維結構，還可以得到其表面硬度、粘彈性、摩擦力等力學特性的表面圖譜 ［10］ 。例如AFM在掃描樣品時，探針尖端作用樣品可使樣品產生可測量的凹陷。當應力與應變力成線性關系時，樣品發生的變形屬彈性變化，即撤銷力時樣品可恢復原有形態。我們利用凹陷的深度數據就能夠獲取有關樣品局部的彈性信息。Alcaraz ［11］ 等利用AFM測量支氣管上皮和肺泡上皮細胞在不同負荷力和作用頻率下的復剪切彈性系數，觀察其變化規律。在樣品表面性能測量中，應該考慮到探針可能同時會受到其他作用而影響實驗數據。在該實驗中作者就針對溶液粘性牽拉力及與樣品接觸的探針幾何形狀引起的偏差予以校正，使測量結果更準確。
2.3 分子間力 將很高的空間分辨率與敏感且準確的力學感應性相結合，是AFM的一個極為顯著的特點。通過將探針連接在彈性系數很小的懸臂上，AFM對力的測量敏感性可達到pn水平。到目前為止，AFM已經廣泛地運用于測量溶液中生物分子間相互作用如與生物反應有關的水合力的研究 ［12］ 。利用這些研究結果還有助于對生物分子結構和機械性能進行分析。例如，蛋白質依靠多種非共價作用而保持其結構穩定，通過機械或化學的方法將蛋白伸展后，可以利用AFM直接測量穩定蛋白結構的作用力，并進一步探究這些力對蛋白結構的影響。近幾年AFM對肌蛋白titin的去折疊研究取得的顯著成果即有力地說明了這一點 ［13］另外，AFM還能夠測量單個分子間微弱的非共價力。例如測量受體-配體的去結合力，若受體固定在基底表面的話，則將與之對應的配體固定于探針表面，使探針功能化。隨探針-樣品的距離逐漸縮小，懸臂受探體-樣品間吸引或排斥力的作用向接近或遠離樣品的方向偏折，懸臂偏折的最大幅度反映分離緊密結合兩分子所需的力。在測量中，有可能會受到探針與表面的非特異性相互作用的干擾 ［14］ 。因此，有必要認真地選擇對照實驗包括使用未功能化探針;或基底所處的溶液中利用游離的配體封閉受體;調節溶液的離子強度或pH，降低靜電力的干預 ［15］ 。除此之外，探針還有可能受溶液粘性牽拉力作用，使撤離速率減慢至記錄數據低于實際的作用力。
2.4 顯微操作 通過在納米級水平調控探針的位置和施加力，AFM可以實現對生物分子進行物理操作如切割生物結構，轉移分子至特定位置。在一定的范圍調整施加力，AFM在成像的同時即可對樣品進行操作。施加力的范圍主要由懸臂的力學常數和探針粗細決定。與標準顯維切割技術相比，AFM對目標區域切割、提取等操作具有更準確的特點。1992年Hansma ［16］ 利用AFM切割遺傳物質DNA分子的特定位置，這是人們首次使用AFM對生物分子進行的可控性納米操縱。隨后它在生物膜的切割 ［17］ 、待研究分子的分離 ［18］ 等方面也得到廣泛的應用。
3 AFM在染色體研究方面的進展
AFM的高分辨成像和簡便的樣品制備過程吸引了眾 多學者利用它對染色體結構進行研究。但早期由于鑲嵌于30nm蛋白質層的RNA吸附在染色體的表面 ［19］ ，同時鹽、細胞殘渣等隨同染色體滴片時吸附于玻片上 ［20］ ，妨礙染色體表面更細微的結構成像。近來隨著染色體制備方法的改善和AFM成像技術的提高，該方面的研究得到進一步的發展。染色體經胃蛋白酶、RNA酶依次作用后，置于溶液中觀察，不僅去除了表面的蛋白質層，而且再次水化后染色體體積增大5～7倍，能夠分辨出樣品表面的染色質纖維所形成的環狀結構 ［19］ 。最近利用該方法使染色體成像橫向和縱向分辨率分別可達到1nm、0.1nm，并且發現染色質纖維是由放射狀排列染色質環與盤繞的螺旋管狀結構共同組成 ［21］ 。在G、C分帶中期染色體的三維結構觀察 ［7］ ，染色單體型畸變識別 ［8］ ，核型分析等方面研究的應用證實了與光學顯微鏡、掃描及透射電鏡等成像工具相比AFM具備獨特的優勢:它不僅能夠識別染色體畸變，同時可以對結構變化進行細微的觀察。除正常染色體的結構及表面性質的研究，AFM還對G分帶染色體形態發生的一系列變化進行觀察。研究發現隨胰蛋白酶作用時間的延長，染色體除周邊之外的其余結構將逐漸發生崩解 ［22］ 。中期染色體經G、C分帶會出現縱向高度的差異 ［23，24］ ，各條帶中染色質纖維排列的松緊度也有所不同 ［25］ 。這些都有助于染色體分帶機制的闡明。對重離子射線誘發染色體畸變分析發現AFM不但識別出染色單體裂隙和單體斷裂，還清楚觀察到單體型畸變的斷裂點纖維狀結構 ［26］ 。這證實了AFM是輻射誘發染色體畸變的結構研究中十分有用的工具。可見，AFM已在染色體結構、物理性質等方面研究獲得很大的進展。另外，作為一種納米操縱工具，AFM還被用于納米切割染色體，提取DNA制作FISH實驗的探針等 ［27］ 。
在亞細胞水平結構研究的基礎上，發揮AFM連接亞細胞結構、分子水平研究的橋梁作用，它有可能在基因定位和功能研究等方面得到進一步的應用與發展。綜上，憑借它對染色體納米量極的成像和顯微操縱，AFM有希望成為結合細胞遺傳學和分子遺傳學的有力工具。
4 展望
1986年，AFM作為一種新的成像技術被研制成功。在之后短短的十余年里它由原有的納米水平單分子成像，逐漸擴展到表面功能的研究，分子間力的測量，可控性分子操作等多個領域。當然，不容忽視，在上述的AFM多種應用中仍存在一些有待進一步完善、解決的問題，也就是說，作為一個新興的研究工具，它同樣也存在著自身的不足。除了在實驗中不斷地分析、探求更好的解決方法之外，我們更應該將AFM與其他成像工具相結合，取長補短，以便能夠更大程度地挖掘其內在潛力，使AFM在生物醫學研究中做出更大的貢獻。相信隨著這項多功能技術的相關工作的不斷發展，它會為形態結構、表面功能、相互作用力等方面研究提供更多、更重要的新發現。 參考文獻
1 Moller C，Allen M，Elings V，Engel A，et al.Tapping-mode atomic force microscopy produces faithful high-resolution images of protein surfaces.Biophys J，1999，77（2）:1150-1158.
2 Avery，J，Ellis DJ，Lang T，et al.A cell free system for regulated exocy-tosis reocytosis in PC12cells.J Cell Biol，2000，148（2）:317-324.
3 Lal R，Lin H.Imaging molecular structure and physiological function of gap junctions and hemijunctions by multimodal atomic force microscopy. Microsc Res Tech，2001，52（3）:273-288.
4 Braet F，de Zanger R，Seynaeve C，et al.A comparative atomic force mi-croscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.J Electron Microsc（Tokyo），2001，50（4）:283-290.
5 Qian X，Hou W，Zhengang L，et al.Direct interactions between molecu-lar chaperones heat-shock protein（Hsp）70and Hsp40:yeast Hsp70Ssal binds the extreme C-terminal region of yeast Hsp40Sisl.Biochem J.2002，1;361（Pt1）:27-34.
6 Liu X，Sugiyama S，Xu Q，et al.Atomic force microscopy study of chro-mosome surface structure changed by protein extraction.Ultrami-croscopy，2003，94（3-4）:217-223.
7 Sit PS，Marchant RE.Surface-dependent conformations of human fib-ringogen observed by atomic force microscopy under aqueous conditions.Thromb Haemost，1999，82（3）:1053-1060.
8 Martin AL，Davies MC，Rackstraw BJ，et al.Observation of DNA-poly-mer condensate formation in real time at a molecular level.FEBS Lett，2000，480（2-3）:106-112.
9 Mulluer DJ，Sass HJ，Muller SA，et al.Surface structures of native bacte-riorhodopsin depend on the molecular packing arrangement in the mem-brance.J Mol Biol，1999，285（5）:1903-1909.
10 Radmacher M.Measuring the elastic properties of living cells by the atomic force microscope.Methods Cell Biol，2002，68:67-90.
11 Alcaraz J，Buscemi L，Grabulosa M，et al.Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy.Biophys J，2003，84（3）:2071-2079.
12 Lee，ImShik;Marchant，et al.Force measurements on the molecular in-teractions between ligand（RGD）and human plateletα Ⅱb β 3 receptor system Surface.Science，2001，491（3）:433.
13 Marszalek PE，Lu H，Li H，et al.Mechanical unfolding intermediates in titin modules.Nature，1999，402，（6757）:100-103.
14 Stuart JK，Hlady V.Reflection interference contrast microscopy com-bined with scanning force microscopy verifies the nature of protein-ligand interaction force measurements.Biophys J，1999，76（1Pt1）: 500-508.
15 Marchant RE，Kang I，Sit PS，et al.Molecular views and measurements of hemostatic processes using atomic force microscopy.Curr Protein Pept Sci，2002，3（3）:249-274.
16 Hansma HG，Vesenka J，Siegerist C，et al.Reproducible imaging and dissection of plasmid DNA under liquid with the atomic force micro-scope.Science，1992，256（5060）:1180-1184.
17 Fotiadis D，Hasler L，Muller DJ，et al.Surface tongue-and-groove contours on lens MIP facilitate cell-to-cell adherence.J Mol Biol，2000，300（4）:779-789.
18 Schabert FA，Henn C，Engel A.Native Escherichia coli OmpF porin surfaces probed by atomic force microscopy.Science，1995，268（5207）:92-94.
19 Tamayo J，Miles M.Human chromosome structure studied by scanning force microscopy after an enzymatic digestion of the covering cell mate-rial.Ultramicroscopy，2000，82（1-4）:245-251.
20 Fritzsche W，Henderson E.Mapping elasticity of rehydrated metaphase chromosomes by scanning force microscopy.Ultramicroscopy，1997，69（3）:191-200.
21 Tamayo J.Structure of human chromosomes studied by atomic force mi-croscopy.J Struct Biol，2003，141（3）:198-207.
22 Sahin FI，Ergun MA，Tan E，et al.The mechanism o G-banding de-tected by atomic force microscopy.Scanning，2000，22（1）:24-27.
23 Tan E，Sahin FI，Ergun MA，et al.C-banding visualized by atomic force microscopy.Scanning，2001，23（1）:32-35.
24 Thalhammer S，Koehler U，Stark RW，et al.GTG banding pattern on human metaphase chromosomes revealed by high resolution atomic-force microscopy.J Microsc，2001，202（Pt3）:464-467.
25 Hoshi O，Ushiki T.Three-dimensional structure of G-banded human metaphase chromosomes observed by atomic force microscopy.Arch Histol Cytol，2001，64（5）:475-482.
